Mikroskopi

Polen tarama elektron mikroskobu görüntüsü

Biyokimyasal laboratuvarda mikroskobik inceleme

Mikroskopi, çıplak gözle görülemeyen nesneleri ve nesnelerin alanlarını (normal gözün çözünürlük aralığı içinde olmayan nesneler) görüntülemek için mikroskopların kullanıldığı teknik alandır. Bilinen üç mikroskopi dalı vardır: X-ışını mikroskopisinin ortaya çıkan alanı ile birlikte optik, elektron ve tarama probu mikroskopisi.

Optik mikroskopi ve elektron mikroskopisi, numune ile etkileşime giren elektromanyetik radyasyon / elektron ışınlarının kırınımını, yansımasını veya kırılmasını ve bir görüntü oluşturmak için dağınık radyasyonun veya başka bir sinyalin toplanmasını içerir. Bu işlem, örneğin geniş alan ışınlamasıyla (örneğin standart ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskopisi) veya numune üzerinde ince bir ışın (örneğin konfokal lazer tarama mikroskopisi ve tarama elektron mikroskopisi) taranarak gerçekleştirilebilir. Tarama probu mikroskopisi, bir tarama probunun ilgilenilen nesnenin yüzeyi ile etkileşimini içerir. Mikroskopinin devrim niteliğindeki biyolojisinin gelişimi, histoloji alanına yol açtı ve bu yüzden yaşam ve fizik bilimlerinde önemli bir teknik olmaya devam ediyor. X-ışını mikroskopisi, yerinde veya 4D çalışmaları için aynı örneğin tekrar tekrar görüntülenmesine izin veren ve daha yüksek çözünürlük tekniklerinden ödün vermeden önce incelenen numunenin "iç kısmını görme" yeteneği sağlayan üç boyutlu ve tahribatsızdır. 3D X-ışını mikroskobu, numuneyi 360 derece döndüren ve görüntüleri yeniden yapılandıran bilgisayarlı tomografi (microCT) tekniğini kullanır. CT tipik olarak düz panel ekran ile gerçekleştirilir. Bir 3D X-ışını mikroskobu, örneğin 4X ila 40X arasında çeşitli hedefler kullanır ve düz bir panel de içerebilir.

Tarihçe

Mikroskopi (optik mikroskopi) alanı en az 17. yüzyıla kadar uzanmaktadır. Daha önceki mikroskoplar, sınırlı büyütme oranına sahip tek lensli büyüteçli gözlükler, en azından 13. yüzyılda gözlük camlarının yaygın olarak kullanılmasına kadar uzanıyor ancak daha gelişmiş bileşik mikroskoplar Avrupa'da ilk olarak 1620'de ortaya çıktı, Mikroskopinin en eski uygulayıcıları arasında Galileo Galilei, 1610'da teleskopunu yakınlaşabileceğini, küçük nesneleri yakından görmek için kullandı 1620 civarında bileşik mikroskobu icat etmiş olan Cornelis Drebbel, 1670'lerde çok yüksek büyütmeli basit bir mikroskop geliştirdi ve genellikle ilk kabul edilen mikroskopçı ve mikrobiyolog olarak kabul edilir.

Optik mikroskopi

Optik veya ışık mikroskopisi, numunenin büyütülmüş bir görüntüsüne izin vermek için numuneden iletilen veya yansıtılan görünür ışığın tek bir mercek veya çoklu merceklerden geçirilmesini içerir. Ortaya çıkan görüntü doğrudan göz tarafından algılanabilir, fotoğrafik bir plaka üzerinde görüntülenebilir veya dijital olarak yakalanabilir. Ekleri olan tek lens veya uygun aydınlatma ekipmanı, numune aşaması ve desteği ile birlikte lensler ve görüntüleme ekipmanı sistemi, temel ışık mikroskobunu oluşturur. En son gelişme, ilgilenilen numunuye odaklanmak için bir CCD kamera kullanan dijital mikroskoptur. Görüntü bir bilgisayar ekranında gösterilir, bu nedenle mercege gerek yoktur.

Sınırlamalar

Standart optik mikroskopinin (parlak alan mikroskopisi) sınırlamaları üç alanda yatmaktadır;

Bu teknik yalnızca karanlık veya güçlü bir şekilde kırılan nesneleri etkili bir şekilde görüntüleyebilir.
Kırınım çözünürlüğü yaklaşık 0.2 mikrometreyle sınırlar (bkz: mikroskop). Bu, pratik büyütme sınırını ~ 1500x ile sınırlar.
Odak düzlemi dışındaki noktalardan odak dışı ışık görüntü netliğini azaltır.

Canlı hücreler özellikle, başarılı bir şekilde incelenmek için yeterli kontrasttan yoksundur, çünkü hücrenin iç yapıları renksiz ve saydamdır. Kontrastı arttırmanın en yaygın yolu, farklı yapıları seçici boyalarla boyamaktır, ancak bu genellikle numuneyi öldürmeyi ve sabitlemeyi içerir. Boyama ayrıca numunenin işlenmesinden kaynaklanan belirgin yapısal detaylar olan ve dolayısıyla numunenin meşru özellikleri olmayan artefaktlar da getirebilir. Genel olarak, bu teknikler hücre yapılarının kırılma endeksindeki farklılıkları kullanır. Parlak alan mikroskopisi bir cam pencereden bakmakla karşılaştırılabilir: camı değil sadece camdaki kiri görür. Cam daha yoğun bir malzeme olduğu için bir fark vardır ve bu, içinden geçen ışığın fazında bir fark yaratır. İnsan gözü fazdaki bu farklılığa duyarlı değildir, ancak fazdaki bu farkı genlikteki bir farka (ışık yoğunluğu) dönüştürmek için akıllı optik çözümler tasarlanmıştır.

Teknikler

Numune kontrastını iyileştirmek veya bir örnekteki belirli yapıları vurgulamak için özel teknikler kullanılmalıdır. Kontrastı arttırmak veya bir örneği etiketlemek için çok çeşitli mikroskopi teknikleri mevcuttur.

Doku kağıdı örneğinde kontrast oluşturmak için kullanılan transillüminasyon tekniklerine dört örnek. 1.559 μm / piksel.
Parlak alan aydınlatması, numune kontrastı numunedeki ışığın soğurulmasından kaynaklanır.
Çapraz polarize ışık aydınlatması, örnek kontrastı polarize ışığın örnek boyunca dönmesinden gelir.
Karanlık alan aydınlatması, örnek kontrastı örnek tarafından dağılmış ışıktan gelir.
Faz kontrast aydınlatması, örnek kontrastı, örnek boyunca farklı yol uzunluklarındaki ışık girişimlerinden gelir.

Parlak alan

Parlak alan mikroskopisi, tüm ışık mikroskopisi tekniklerinin en basitidir. Numune aydınlatması iletilen beyaz ışıkla yapılır, yani aşağıdan aydınlatılır ve yukarıdan gözlemlenir. Sınırlamalar, çoğu biyolojik örneğin düşük kontrastını ve odak dışı malzemenin bulanıklığı nedeniyle düşük görünür çözünürlüğü içerir. Tekniğin basitliği ve gereken minimum numune hazırlığı önemli avantajlardır.

Eğik aydınlatma

Eğik (yandan) aydınlatmanın kullanılması görüntüye üç boyutlu (3D) bir görünüm verir ve aksi takdirde görünmez özellikleri vurgulayabilir. Bu yönteme dayanan daha yeni bir teknik, hücre kültüründe kullanılmak üzere ters çevrilmiş mikroskoplarda bulunan bir sistem olan Hoffmann'ın modülasyon kontrastıdır. Eğik aydınlatma, parlak alan mikroskobu ile aynı sınırlamalardan muzdariptir (birçok biyolojik örneğin düşük kontrastı; odak dışı nesneler nedeniyle düşük görünür çözünürlük).

Karanlık alan

Karanlık alan mikroskobu, boyanmamış, şeffaf örneklerin kontrastını geliştirmek için bir tekniktir. Karanlık alan aydınlatması, görüntü düzlemine giren doğrudan iletilen (dağılmayan) ışık miktarını en aza indirmek için dikkatle hizalanmış bir ışık kaynağı kullanır ve yalnızca örnek tarafından dağıtılan ışığı toplar. Karanlık alan, çok az ekipman kurulumu veya numune hazırlığı gerektirirken, özellikle şeffaf nesnelerdeki görüntü kontrastını önemli ölçüde artırabilir. Bununla birlikte, teknik birçok biyolojik numunenin son görüntüsünde düşük ışık yoğunluğundan muzdariptir ve düşük görünür çözünürlükten etkilenmeye devam etmektedir.

Rheinberg aydınlatması, yüksek diyafram açıklığındaki ışık ışınlarının düşük diyafram açıklığından farklı renklendirilmesi için şeffaf, renkli filtrelerin kondansatörden hemen önce yerleştirildiği özel bir karanlık alan aydınlatması varyantıdır (örn. nesne kendinden parlak kırmızı görünür). Diğer renk kombinasyonları mümkündür, ancak bunların etkinliği oldukça değişkendir.

Dispersiyon renklendirme

Dispersiyon renklendirme, renksiz bir nesnenin renkli görüntüsüyle sonuçlanan optik bir tekniktir. Bu optik bir boyama tekniğidir ve bir renk efekti oluşturmak için herhangi bir leke veya boya gerektirmez. Daha geniş dispersiyon renklendirme tekniğinde kullanılan beş farklı mikroskop konfigürasyonu vardır. Parlak alan Becke çizgisi, eğik, karanlık alan, faz kontrastı ve objektif stop dispersiyon renklendirme içerir.

Faz kontrastı

Daha sofistike teknikler, optik yoğunlukta oransal farklılıklar gösterecektir. Faz kontrastı, kırılma indeksindeki farklılıkları kontrasttaki fark olarak gösteren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Hollandalı fizikçi Frits Zernike tarafından 1930'larda geliştirildi (1953'te Nobel Ödülü'ne layık görüldü). Örneğin bir hücredeki çekirdek, çevresindeki sitoplazmaya karşı karanlık bir şekilde ortaya çıkacaktır. Kontrast mükemmel; ancak kalın nesnelerle kullanım için değildir. Sıklıkla, küçük nesnelerin etrafında bile, ayrıntıyı gizleyen bir hale oluşur. Sistem, kondansatörde bir ışık konisi üreten dairesel bir halkadan oluşur. Bu koni, faz-hedefi içinde benzer boyuttaki bir halka üzerine bindirilir. Her hedefin farklı bir boyut halkası vardır, bu nedenle her hedef için başka bir kondenser ayarı seçilmelidir. Amaçdaki halka özel optik özelliklere sahiptir: her şeyden önce, doğrudan ışığı yoğunluğu azaltır, ancak daha da önemlisi, yaklaşık çeyrek dalga boyunda yapay bir faz farkı yaratır. Bu doğrudan ışığın fiziksel özellikleri değiştikçe, dağılmış ışığa müdahale edilerek faz kontrast görüntüsü ortaya çıkar. Faz kontrast mikroskopisinin bir dezavantajı halo oluşumudur (halo-ışık halkası).

Diferansiyel girişim kontrastı

Yüksek ve çok daha pahalı olan parazit kontrastının kullanılmasıdır. Optik yoğunluktaki farklılıklar kabartmadaki farklılıklar olarak ortaya çıkacaktır. Georges Nomarski'ye göre, bir hücredeki bir çekirdek aslında en sık kullanılan diferansiyel girişim kontrast sisteminde bir globül olarak görünecektir. Bununla birlikte, bunun optik bir etki olduğu ve kabartma gerçek şekle benzemesi gerekmediği unutulmamalıdır. Kontrast çok iyidir ve kondenser açıklığı tamamen açık olarak kullanılabilir, böylece alan derinliği azaltılır ve çözünürlük en üst düzeye çıkarılır.

Girişim yansıması

Parazit kullanan ek bir teknik, parazit yansıtıcı mikroskopidir (yansıyan parazit kontrastı veya RIC olarak da bilinir). Bir parazit sinyali üretmek için slayda hücre yapışmasına dayanır. Cama bağlı bir hücre yoksa parazit olmayacaktır.

Girişim yansıma mikroskopisi, DIC tarafından kullanılan aynı elementler kullanılarak, ancak prizmalar olmadan elde edilebilir. Ayrıca, algılanan ışık yansıtılır ve DIC kullanıldığında olduğu gibi iletilmez.

floresan

Bazı bileşikler yüksek enerjili ışıkla aydınlatıldığında daha düşük frekansta ışık yayarlar. Bu etki floresans olarak bilinir. Genellikle numuneler kimyasal yapılarına göre karakteristik otofloresan görüntülerini gösterir.

Bu yöntem, modern yaşam bilimlerinde kritik öneme sahiptir, çünkü son derece hassas olabildiğinden, tek moleküllerin saptanmasına izin verir. Farklı yapıları veya kimyasal bileşikleri lekelemek için birçok farklı floresan boya kullanılabilir. Özellikle güçlü bir yöntem, immün boyamada olduğu gibi bir florofora bağlı antikorların kombinasyonudur. Yaygın olarak kullanılan floroforların örnekleri, flüoresein veya rodamindir.

Antikorlar, kimyasal bir bileşik için özel olarak hazırlanabilir. Örneğin, sıklıkla kullanılan bir strateji, genetik koda (DNA) dayanan yapay protein üretimidir. Bu proteinler daha sonra, proteine bağlanan antikorlar oluşturarak tavşanları immünize etmek için kullanılabilir. Antikorlar daha sonra kimyasal olarak bir florofora bağlanır ve incelenen hücrelerdeki proteinleri izlemek için kullanılır.

Eşodaklı

Konfokal mikroskopi, odak dışı ışığın detektöre ulaşmasını önlemek için bir tarama noktası ve bir iğne deliği kullanır. Tam örnek aydınlatmaya kıyasla, konfokal mikroskopi biraz daha yüksek çözünürlük sağlar ve optik bölümlemeyi önemli ölçüde geliştirir. Dolayısıyla, konfokal mikroskopi, 3D yapının önemli olduğu yerlerde yaygın olarak kullanılır.

Tek düzlemli aydınlatma mikroskobu ve hafif tabaka floresan mikroskopisi

Işığı dar bir açıyla silindirik bir mercek içinden odaklayarak veya objektif eksenine dik bir düzlemde bir ışık çizgisini tarayarak oluşturulan bir ışık düzlemi kullanılarak, yüksek çözünürlüklü optik bölümler alınabilir. Tek düzlemli aydınlatma veya hafif sac aydınlatması da, çok prizma ışın genişleticileri içeren ışın şekillendirme teknikleri kullanılarak gerçekleştirilir. Görüntüler CCD'ler tarafından yakalanır. Bu varyantlar çok hızlı ve yüksek sinyal / parazit oranına sahip görüntü yakalamaya izin verir.

Geniş alanlı çok fotonlu mikroskopi

Geniş alanlı çok fotonlu mikroskopi, nesnenin geniş bir alanının tarama gerekmeksizin aydınlatıldığı ve görüntülendiği ultra hızlı görüntüleme için tasarlanmış optik doğrusal olmayan bir görüntüleme tekniğini ifade eder. İki fotonlu floresan veya ikinci harmonik üretimi gibi doğrusal olmayan optik işlemleri indüklemek için yüksek yoğunluklara ihtiyaç vardır. Çok resimli mikroskopların taranmasında yüksek yoğunluklara, ışığın sıkıca odaklanmasıyla ulaşılır ve görüntü, numunenin sahne veya ışın taraması ile elde edilir. Geniş alanlı çok resimli mikroskopide yüksek yoğunluklara en iyi şekilde geniş bir görüş alanına (~ 100 um) ulaşmak için optik olarak güçlendirilmiş darbeli bir lazer kaynağı kullanılarak ulaşılır. Bu durumda görüntü, tarama gerektirmeden bir CCD ile tek bir kare olarak elde edilir, bu da tekniği ilgili nesne boyunca dinamik süreçleri aynı anda görselleştirmek için özellikle yararlı hale getirir. Geniş alanlı çok resimli mikroskopi ile kare hızı, çok resimli tarama mikroskopisine kıyasla 1000 kata kadar artırılabilir.

Dekonvolüsyon

Floresan mikroskopisi karmaşık bir ortamda özel olarak etiketlenmiş yapıları göstermek ve biyolojik yapıların üç boyutlu bilgilerini sağlamak için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bu bilgi, aydınlatma üzerine, flüoresan etiketli tüm yapıların, odakta olup olmadıklarına bakılmaksızın, ışık yayması gerçeğiyle bulanıklaşmaktadır. Böylece belirli bir yapının görüntüsü her zaman odak dışı olan yapılardan gelen ışığın katkısıyla bulanıklaşır. Bu fenomen özellikle yüksek çözme gücüne sahip hedefler, tipik olarak yüksek sayısal açıklığa sahip yağ daldırma hedefleri kullanıldığında kontrast kaybına neden olur.

Darbeli bir THz lazer görüntüleme sisteminin matematiksel olarak modellenmiş Nokta Yayılma Fonksiyonu.

Bununla birlikte, bulanıklığa ışık saçılması gibi rastgele süreçler neden olmaz, ancak mikroskop görüntüleme sistemindeki görüntü oluşumunun optik özellikleri ile iyi tanımlanabilir. Küçük bir floresan ışık kaynağı (esas olarak parlak bir nokta) olarak düşünülürse, bu noktadan gelen ışık, nokta daha fazla odak dışı hale geldiğinden perspektifimizden daha da yayılır. İdeal koşullar altında, bu nokta kaynağının üçüncü (eksenel) boyutta bir "kum saati" şekli üretir. Bu şekle mikroskop görüntüleme sisteminin nokta yayılma fonksiyonu (PSF) denir. Herhangi bir flüoresans görüntüsü, bu tür çok sayıda küçük flüoresan ışık kaynağından oluştuğu için, görüntünün "nokta yayma fonksiyonu tarafından kıvrıldığı" söylenir. Terahertz lazer darbeli görüntüleme sisteminin matematiksel olarak modellenmiş PSF'si sağda gösterilmiştir.

Alt kırınım teknikleri

Süper çözünürlüklü mikroskopi örneği. Her3 ve Her2, meme kanseri ilacı Trastuzumab'ın hedefi, bir kanser hücresi içinde.

Son zamanlarda kırınım bariyerini aşan çok sayıda süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği geliştirilmiştir.

Bu çoğunlukla yeterince statik bir numunenin birden çok kez görüntülenmesi ve uyarma ışığının değiştirilmesi veya görüntüdeki stokastik değişikliklerin gözlenmesi ile elde edilir. PSF kaynaklı bulanıklığı ortadan kaldıran ve matematiksel olarak 'doğru' bir ışık kaynağı atayan önceki bölümde açıklanan dekonvolüsyon yöntemleri, bir pikselin değerinin ne anlama geldiğini biraz farklı bir şekilde anlasa da kullanılır. Çoğu zaman, tek bir florofor alınan tek bir görüntüde tek bir bloba katkıda bulunur, görüntülerdeki lekeler hesaplanan konumlarıyla değiştirilebilir ve çözünürlüğü kırınım sınırının çok altına düşürür.

Seri zaman kodlu amplifiye mikroskopi

Seri zaman kodlu güçlendirilmiş mikroskopi (STEAM), hassasiyet ve hız arasındaki temel değiş tokuşu atlatmak için optik görüntü amplifikasyonu ve bir gereksinimi ortadan kaldırmak için tek pikselli bir fotodetektör kullanarak ultra hızlı deklanşör hızı ve kare hızı sağlayan bir görüntüleme yöntemidir. dedektör dizisi ve okuma süresi sınırlamaları Yöntem, en son teknoloji CCD ve CMOS kameralardan en az 1000 kat daha hızlıdır. Sonuç olarak, şok dalgaları, mikroakışkanlar, MEMS ve lazer cerrahisinin gerçek zamanlı teşhisi ve değerlendirilmesi de dahil olmak üzere yüksek görüntü elde etme oranları gerektiren çok çeşitli bilimsel, endüstriyel ve biyomedikal uygulamalar için faydalıdır.

X-ışını

Çözünürlük ışığın dalga boyuna bağlıdır. Elektron mikroskopisi 1930'lardan beri ışık yerine elektron demeti kullanılarak geliştirilmiştir. Elektron ışınının çok daha küçük dalga boyu nedeniyle çözünürlük çok daha yüksektir.

Daha az yaygın olmasına rağmen, X-ışını mikroskopisi de 1940'ların sonlarından beri geliştirilmiştir. X-ışını mikroskopisinin çözünürlüğü ışık mikroskobu ile elektron mikroskobu arasındadır.

Elektron mikroskobu

Alt kırınım mikroskopisinin icadına kadar, ışığın dalga boyu geleneksel mikroskopinin çözünürlüğünü yaklaşık 0.2 mikrometreyle sınırladı. Daha yüksek çözünürlük elde etmek için, çok daha küçük dalga boyuna sahip bir elektron ışınının kullanılması elektron mikroskoplarında kullanılır.

Tarama probu mikroskopisi

Bu bir alt kırınım tekniğidir. Tarama probu mikroskoplarının örnekleri atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Tarama tünelleme mikroskobu, fotonik kuvvet mikroskobu ve rekürrens izleme mikroskobudur. Tüm bu yöntemler, neredeyse düz olması beklenen bir nesnenin yüzeyini taramak için bir katı prob ucunun fiziksel temasını kullanır.

Ultraviyole mikroskopi

Ultraviyole mikroskopların iki ana amacı vardır. Birincisi, görüntü çözünürlüğünü standart optik mikroskopların kırınım sınırının ötesinde artırmak için ultraviyole elektromanyetik enerjinin daha kısa dalga boyunu kullanmaktır. Bu teknik, modern yarı iletkenlerde bulunanlar gibi çok küçük özelliklere sahip cihazların tahribatsız muayenesi için kullanılır. UV mikroskopları için ikinci uygulama, ışığın numunenin içindeki moleküller ile etkileşimi nedeniyle, tek tek numunelerin cevabının çevrelerine göre arttığı kontrast arttırıcıdır. Bir örnek, protein kristallerinin büyümesidir. Tuz çözeltilerinde protein kristalleri oluşur. Tuz ve protein kristallerinin her ikisi de büyüme sürecinde oluştuklarından ve her ikisi de genellikle insan gözüne saydam olduklarından, standart bir optik mikroskopla ayırt edilemezler. Protein triptofanı 280 nm'de ışığı emdikçe, 280 nm bant geçiren filtreli bir UV mikroskobu ile görüntüleme, iki kristal türünü ayırt etmeyi kolaylaştırır. Tuz kristalleri şeffafken protein kristalleri karanlık görünür.

Kızılötesi mikroskopi

Kızılötesi mikroskopi terimi, kızılötesi dalga boylarında gerçekleştirilen mikroskopiyi ifade eder. Tipik cihaz konfigürasyonunda, bir Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektrometresi (FTIR) bir optik mikroskop ve bir kızılötesi dedektör ile birleştirilir. Kızılötesi dedektör, tek noktalı bir dedektör, doğrusal bir dizi veya bir 2D odak düzlemi dizisi olabilir. FTIR, kızılötesi spektroskopi yoluyla kimyasal analiz yapma kabiliyeti sağlar ve mikroskop ve nokta veya dizi detektörü, bu kimyasal analizin uzaysal olarak çözülmesini, örneğin numunenin farklı bölgelerinde yapılmasını sağlar. Bu nedenle, teknik aynı zamanda kızılötesi mikrospektroskopi olarak da adlandırılır (alternatif bir mimari, uçan bir hedef üzerinde ayarlanabilir bir kızılötesi ışık kaynağı ve tek nokta dedektörünün kombinasyonunu içerir). Bu teknik, görüntü kontrastının, bireysel örnek bölgelerinin kullanıcı tarafından seçilen belirli IR dalga boylarına, genellikle spesifik IR absorpsiyon bantlarına ve ilişkili moleküler rezonanslara tepkisi ile belirlendiği kızılötesi kimyasal görüntüleme için sıklıkla kullanılır. Geleneksel kızılötesi mikrospektroskopinin önemli bir sınırlaması, uzaysal çözünürlüğün kırınım sınırlaması olmasıdır. Spatial çözünürlük özellikle ışığın dalga boyu ile ilgili bir rakamla sınırlıdır. Pratik IR mikroskopları için, uzamsal çözünürlük kullanılan spesifik tekniğe ve cihaza bağlı olarak dalga boyunun 1-3 katı ile sınırlıdır. Orta IR dalga boyları için, bu ~ 3-30 μm pratik bir uzamsal çözünürlük sınırı belirler. Alt kırınım mikroskopisinin IR versiyonları da (yukarıya bakınız) mevcuttur. Bunlar arasında IR NSOM, fototermal mikrospektroskopi ve atomik kuvvet mikroskop tabanlı kızılötesi spektroskopi (AFM-IR) bulunur.